Cultivo celular primario
¿Qué es el cultivo celular primario?
El cultivo celular primario es el cultivo de células adquiridas directamente de un organismo multicelular. La primera etapa en el cultivo primario es obtener tejidos de un ser humano o un animal; a menudo se trata de masas de tejido que se deben desagregar mediante procedimientos químicos, mecánicos o enzimáticos para separar los tejidos y obtener células viables. Estas células vivas desagregadas luego se estimulan para que proliferen en recipientes de cultivo utilizando medios sofisticados y especializados.
El cultivo de células primarias se puede dividir según las propiedades de las células, como la diferenciación, la adhesión a las superficies y la estructura morfológica. Las células se cultivan y proliferan en un medio de crecimiento adecuado hasta que alcanzan la confluencia (frase utilizada para describir la condición en la que las células ocupan toda el área de crecimiento del recipiente de cultivo) en todos los métodos de cultivo celular primario.
Los cultivos de células primarias están más estrechamente relacionados con la condición fisiológica de las células in vivo y producen datos más significativos sobre los sistemas vivos. Los cultivos primarios son células que se han obtenido recientemente de un ser vivo y se cultivan in vitro (fuera del cuerpo vivo y en un entorno artificial). Las células primarias se clasifican según el género del que se obtuvieron, así como la especie o el tipo de tejido.
Cada tipo de tejido de mamífero se deriva de la capa germinal embrionaria, que consta de células de ectodermo, endodermo y mesodermo que se diferencian en numerosos tipos de células que se organizan en estructuras terciarias como piel, músculo, órganos internos, hueso y cartílago, el sistema nervioso, sangre y vasos sanguíneos.
Las células epiteliales, fibroblastos, queratinocitos, melanocitos, células endoteliales, células musculares, células madre hematopoyéticas y mesenquimales son los tipos de células más comunes identificados en cultivos celulares primarios. Una línea celular se define como las células que se subcultivan por primera vez a partir de un cultivo primario. El cultivo secundario se describe como un paso posterior de la línea celular, en el que los cultivos celulares se mueven secuencialmente a través de los medios de cultivo.
¿Cuáles son las aplicaciones del cultivo celular primario?
El cultivo celular es un método popular en la investigación de biología celular y molecular, y se usa con frecuencia en entornos terapéuticos. El cultivo celular primario puede ser un sistema modelo eficaz para investigar la fisiología y la bioquímica celular, la toxicidad y el metabolismo de los medicamentos y otros usos medicinales. Investigadores de todo el mundo emplean el cultivo celular primario porque ayuda a preservar la uniformidad, la eficiencia y la reproducibilidad de los resultados, además de ser un buen modelo mímico de entornos fisiológicos in vivo. Los siguientes son ejemplos de aplicaciones de cultivos celulares primarios:
Sistema de modelo 3D:
El cultivo celular primario se puede utilizar para explorar la biología celular y la bioquímica, las interacciones celulares, las interacciones patológicas, los efectos de los medicamentos y la toxicología, el envejecimiento y una variedad de otros temas de investigación.
Investigación sobre el cáncer:
La diferencia entre células normales y cancerosas puede examinarse utilizando un cultivo celular primario como modelo para la detección de marcadores sobreexpresados o subexpresados que conducen a la activación maligna. Además, las células primarias se utilizan a menudo como modelos de control en la investigación contra el cáncer.
Virología:
Los cultivos de células primarias se usan para replicar virus y también se pueden usar para detectar y aislar virus para estudiar su ciclo de crecimiento y desarrollo. Las células primarias también se utilizan en virología para estudiar el modo y el mecanismo de infección del virus.
Pruebas de toxicidad:
El cultivo celular primario se utiliza para estudiar los efectos de nuevos fármacos, cosméticos y productos químicos en las células. Las células primarias también se utilizan para determinar la dosis máxima permisible de los fármacos.
Producción de vacunas:
Las células primarias cultivadas se utilizan en la replicación viral para crear vacunas. El cultivo celular primario se utiliza para crear vacunas contra la poliomielitis, la rabia, la varicela y la hepatitis B.
Proteína modificada genéticamente:
Los cultivos de células primarias se utilizan para crear proteínas modificadas genéticamente, como anticuerpos monoclonales, insulina, hormonas, etc. Muchos tratamientos se están remodelando utilizando tecnología recombinante.
Tejido u órgano de reemplazo:
En la curación de heridas y otras aplicaciones de ingeniería de tejidos, el cultivo de células primarias se puede emplear como tejido u órganos de reemplazo. La piel artificial, por ejemplo, se puede crear a partir de células primarias para curar a pacientes con quemaduras y úlceras. Se está investigando el cultivo de órganos artificiales, como el hígado , el riñón y el páncreas . Muchos investigadores están interesados en el cultivo de células madre porque estas células tienen la capacidad de autoproliferar y diferenciarse en varios linajes celulares. Actualmente se están probando muchos usos terapéuticos de las células madre adultas para la regeneración de tejidos/órganos y tecnologías de reemplazo.
Detección y desarrollo de fármacos:
Los cultivos celulares primarios se utilizan para investigar la citotoxicidad y las dosis seguras de medicamentos. Como resultado, los cultivos celulares primarios juegan un papel importante en el sector farmacéutico.
Propiedades básicas de las células primarias:
Las células primarias se someten a un número limitado de divisiones celulares antes de acercarse a la senescencia después de adaptarse a las condiciones de cultivo in vitro. El límite de Hayflick, las necesidades alimentarias, las condiciones de cultivo y la competencia con la que se gestionan y subcultivan limitan el número de veces que se puede pasar un cultivo celular básico. Las líneas celulares inmortalizadas a través de la transformación viral o tumorigénica, por otro lado, a menudo experimentan una división celular interminable y tienen una longevidad indefinida. Además, a diferencia de las líneas de células tumorales, los cultivos de células primarias son exigentes y requieren condiciones de crecimiento personalizadas, como la inclusión de citoquinas específicas de tejido y factores de crecimiento para la proliferación en medios de crecimiento sin suero o con bajo contenido de suero.
¿Cuál es la diferencia entre cultivo celular primario y secundario?
Antes de que las células alcancen la confluencia, deben subcultivarse porque la fatiga nutricional, la acumulación de metabolitos tóxicos y el espacio accesible para el crecimiento restringen la proliferación. La inhibición por contacto es un componente extra en el caso de células adherentes, cuando las células dejan de multiplicarse cuando alcanzan la confluencia y ocupan la superficie de un recipiente de cultivo. La confluencia puede ser más difícil de evaluar en cultivos de células suspendidas, sin embargo, las células tienden a formar grumos en el medio.
Las células de cultivo de células primarias tienen una vida útil limitada, ya que solo pueden dividirse un cierto número de veces. Para estimular el desarrollo y la proliferación continuos, deben subcultivarse en medios de cultivo nuevos o en un sustrato de crecimiento nuevo antes de alcanzar la confluencia. Esto se conoce como cultivo celular secundario. Un mecanismo similar destaca los cultivos de células primarias y secundarias, pero difieren en términos de tiempo de vida, importancia biológica y origen celular.
A medida que avanza el proceso de cultivo predominan las células con mayor potencial de crecimiento y aumenta el grado de homogeneidad genética y morfológica. Las células pueden desarrollar líneas celulares secundarias inmortalizadas como resultado del cambio genético. Las líneas celulares inmortalizadas, que se crean mediante la adición de virus o sustancias químicas, se utilizan comúnmente en la investigación porque su inmortalidad (la capacidad de dividirse infinitamente) permite a los investigadores realizar estudios en células genéticamente idénticas varias veces.
De manera similar, las células malignas se pueden emplear para generar líneas celulares de cáncer continuas con períodos de producción cortos y la capacidad de transmitirse sin fin. Cuando las células no se transforman, pasan por un número limitado de duplicaciones de población y, por lo tanto, se denominan líneas celulares finitas.
Trabajar con cultivos primarios y secundarios tiene ventajas y desventajas, y la decisión está determinada por el propósito del experimento. Los cultivos de células primarias suelen preferirse a las líneas celulares porque son más representativos del tejido de origen. A su vez, los cultivos primarios son la plataforma experimental más grande para las investigaciones in vivo porque tienen la misma composición genética que su tejido original correspondiente y muestran características que las células cultivadas no tienen. La principal limitación del cultivo celular primario es su vida útil limitada. Además, es fundamental evaluar las consecuencias y el procedimiento para obtener una biopsia significativa o un modelo animal.
Los cultivos celulares secundarios, por otro lado, pueden durar indefinidamente ya que se reponen con nutrientes frescos y sustrato a intervalos regulares. Las líneas celulares, sin embargo, mutan. Los cultivos de células secundarias pueden llegar a ser completamente indistinguibles de su tejido original como resultado del paso continuo de células debido a alteraciones genéticas y morfológicas.
Otra limitación en el cultivo primario es la generación de suficientes células primarias para el análisis. En general, esto solo se puede resolver comenzando con una mayor cantidad de tejido, lo que puede ser difícil de hacer. Sin embargo, los desarrollos en la sensibilidad de las herramientas analíticas están proporcionando una solución. Las tecnologías de una sola célula, como la secuenciación, las transferencias Western y la citometría de masas, por ejemplo, requieren cantidades relativamente pequeñas de material inicial, lo que reduce la necesidad de cultivar grandes cantidades de células originales.
El cultivo celular en 3D, por otro lado, permite que las células crezcan e interactúen con un marco extracelular en las tres dimensiones. Como resultado, los cultivos 3D se asemejan más a su condición fisiológica natural, lo que permite que las células interactúen entre sí y con la matriz extracelular. Debido a su precisión en la predicción de reacciones in vivo, esta técnica ha demostrado ser revolucionaria en campos como el descubrimiento y desarrollo de fármacos. Esto ha dado como resultado tecnologías de vanguardia que brindan modelos altamente contextuales para la detección y el desarrollo de fármacos, como organoides derivados de pacientes y órganos en un chip.
¿Cuáles son los beneficios de usar celdas primarias?
Los cultivos celulares primarios se utilizan con frecuencia como herramientas in vitro para la investigación biológica preclínica y de investigación, como las investigaciones de la comunicación intercelular e intracelular, la biología del desarrollo y la elucidación del mecanismo de la enfermedad en enfermedades como el cáncer, la enfermedad de Parkinson y la diabetes.
Históricamente, los investigadores han utilizado líneas celulares inmortalizadas en estudios de función tisular; sin embargo, el uso de líneas celulares con mutaciones graves y anomalías cromosómicas proporciona marcadores deficientes del fenotipo celular normal y del desarrollo de la enfermedad en etapa temprana. El uso de células primarias, que solo se mantienen in vitro durante breves períodos de tiempo, es actualmente el mejor representante del principal componente funcional del tejido (in vivo) a partir del cual se producen.
¿Cómo se realiza el cultivo celular primario?
Puede ser ventajoso incorporar un antibiótico en los medios de crecimiento durante la creación de cultivos primarios para limitar la contaminación proveniente del tejido huésped. Estos pueden comprender una combinación de gentamicina, penicilina, estreptomicina y anfotericina B. Sin embargo, no se recomienda el uso de antibióticos a largo plazo ya que ciertos compuestos, como la anfotericina B, pueden ser dañinos para las células con el tiempo.
Mantenimiento:
Cuando las células se han conectado a la superficie de la placa de cultivo, comienza la fase de mantenimiento. El apego normalmente comienza aproximadamente 24 horas después del inicio del cultivo. Al iniciar un cultivo de células primarias crioconservadas, es fundamental eliminar el medio desperdiciado después de que las células se hayan adherido, ya que el crioprotector es tóxico para las células primarias y puede reducir la viabilidad posterior a la descongelación.
Es hora de subcultivar cuando las células han alcanzado el porcentaje necesario de confluencia celular y se están multiplicando activamente. Debido a que las células posconfluentes pueden experimentar diferenciación y demostrar una proliferación reducida después del paso, es ideal subcultivar cultivos de células primarias antes de que alcancen el 100 % de confluencia.
Confluencia celular:
La fracción del contenedor de cultivo ocupada por células conectadas se denomina confluencia celular. Por ejemplo, una confluencia celular del 100 % indica que toda la superficie está cubierta por células, mientras que una confluencia del 50 % significa que casi la mitad de la superficie está cubierta. Es una métrica crítica para monitorear y evaluar en el cultivo celular primario, ya que varios tipos de células requieren diferentes puntos finales de confluencia, después de lo cual deben subcultivarse.
Subcultura:
Las células dependientes del anclaje se desarrollan en monocapas y requieren subcultivos repetidos para mantener un crecimiento exponencial. El subcultivo de monocapas requiere la disolución de las conexiones intercelulares e intracelulares entre las células y la superficie. La mayoría de las células primarias adherentes requieren la ruptura del enlace de unión a proteínas usando una dosis baja de una enzima proteolítica como la tripsina/EDTA. Después de disociarse y dispersarse en una solución unicelular, las células se cuentan y diluyen a la concentración adecuada antes de transferirlas a recipientes de cultivo frescos donde se volverán a unir y dividir.
Conteo de células:
Los hemocitómetros se utilizan con frecuencia para evaluar el número de células y la viabilidad utilizando un tinte de exclusión como Trypan Blue o Erythrosin B. Un hemocitómetro es un portaobjetos de vidrio que tiene dos cámaras de conteo, una en cada lado. Cada cámara de conteo tiene una superficie espejada con una cuadrícula de 9 cuadrados de conteo que miden 3 × 3 mm2. Las cámaras tienen paredes laterales elevadas que permiten sujetar un cubreobjetos exactamente 0,1 mm2 por encima del suelo de la cámara. Cada uno de los nueve cuadrados de conteo tiene una capacidad de 0,0001 ml.
Criopreservación y recuperación:
Para reducir el daño celular y la muerte durante los procesos de crioconservación y descongelación, se debe tener especial cuidado. La crioconservación de células humanas funciona mejor cuando se usa un crioprotector, como DMSO o glicerol. La mayoría de los cultivos celulares primarios se pueden crioconservar en una combinación de medio de crecimiento completo al 80 %, FBS al 10 % y DMSO al 10 %. Para evitar la producción de cristales de hielo dentro de las células, el proceso de congelación debe ser gradual, a un ritmo de -1°C por minuto. Los cultivos se congelan y se mantienen en la fase de vapor de nitrógeno líquido oa temperaturas inferiores a -130 °C.
Características para el desarrollo eficiente de cultivos primarios
El cultivo primario se refiere a los procedimientos de cultivo utilizados después del aislamiento celular pero antes del primer subcultivo. Normalmente se utilizan grandes masas de tejido para preparar cultivos primarios. Como resultado, estos cultivos pueden contener una amplia gama de células diferenciadas, como fibroblastos, linfocitos, macrófagos y células epiteliales.
De acuerdo con las experiencias de los empleados que trabajan en laboratorios de cultivo de tejidos, se recomiendan los siguientes criterios/características para el desarrollo eficiente de cultivos primarios:
- Los tejidos embrionarios se prefieren a los tejidos adultos para cultivos primarios. Esto se debe a que las células embrionarias pueden disgregarse rápidamente y producir células más viables, además de proliferar rápidamente in vitro.
- Debe aumentarse el número de células utilizadas en el cultivo primario porque su tasa de supervivencia es significativamente menor (en comparación con los subcultivos).
- Para su uso en cultivos primarios, los tejidos deben tratarse con una lesión celular mínima. Las células muertas también deben eliminarse.
- Se recomienda elegir un medio adecuado (idealmente rico en nutrientes). El suero bovino fetal se prefiere al suero de ternera o caballo para la adición de suero.
- Se requiere centrifugación para eliminar las enzimas utilizadas en la desagregación celular.
Contaminación del cultivo celular
Si se descubre un problema más generalizado, se deben desechar todos los cultivos contaminados y los medios no utilizados asociados abiertos durante este tiempo, se debe inspeccionar y limpiar el equipo, se deben revisar las operaciones de cultivo celular y se debe implementar el aislamiento de otros laboratorios hasta que se resuelva el problema. . La capacitación del personal, la estructura del laboratorio, la cuarentena adecuada para nuevos cultivos o líneas celulares, la limpieza y el mantenimiento y el control de calidad son aspectos importantes para prevenir la contaminación en las instalaciones de cultivo celular.
Conclusión
Un cultivo celular primario se crea mediante la inoculación directa de células de tejido animal o humano en medios de cultivo. El tejido a menudo se rompe en pedazos diminutos antes de ser tratado con tripsina, una enzima proteolítica que desagrega el tejido en células individuales.
Los cultivos de células primarias mantienen la mayoría de las características de las células de las que se derivaron y, a menudo, dependen del anclaje. Estas células muestran "inhibición de contacto", lo que hace que las células se alineen en hebras paralelas fuertemente orientadas. Estas células se replican en cualquier contenedor hasta que alcanzan una densidad máxima, momento en el que dejan de crecer. En términos de número de cromosomas, estas células a menudo conservan su cariotipo diploide.
La utilización de células primarias implica una variedad de dificultades. Uno de los desafíos más importantes para los cultivadores de células primarias es la accesibilidad limitada de las células debido a las limitaciones de suministro de tejidos de donantes, las dificultades con el aislamiento/purificación de células, la garantía de calidad y la consistencia, y las amenazas de contaminación. La comparabilidad de los datos también es una preocupación importante con la utilización de células primarias, debido a las variaciones en los productos químicos utilizados y los procesos empleados por varios científicos y laboratorios para identificar y cultivar células primarias.
Los cultivos primarios son cultivos recién aislados de sistemas de mamíferos hasta que se subcultivan. En esta etapa, a menudo son heterogéneos, pero aún se parecen mucho a los tipos de células originales y muestran características específicas de tejido.
Después del subcultivo o pase inicial, el cultivo principal se transforma en líneas celulares que pueden propagarse o subcultivarse muchas veces. La línea celular morirá o cambiará a una línea celular continua después de múltiples subcultivos en medio fresco. Existen muchas diferencias entre estas líneas celulares y los cultivos originales, incluidas modificaciones en
- Citomorfología
- Mayor tasa de crecimiento
- Aumento de la variación cromosómica
- Tumorigenicidad
La transformación in vitro se ocupa principalmente de adquirir una vida útil ilimitada. Las células animales se pueden cultivar de dos formas: en suspensión o adheridas a una superficie sólida. Carecen de inhibición por contacto, y algunos son independientes del anclaje y pueden cultivarse en cultivos en suspensión. El cariotipo de las líneas celulares varía mucho. Las líneas celulares continuas suelen ser aneuploides, con números cromosómicos que oscilan entre diploides y tetraploides.
La técnica de cultivo celular se ha convertido en un enfoque estándar y popular debido a sus numerosos usos en biología celular, biotecnología e investigación médica. El aislamiento de células primarias a partir de células cancerosas es un componente importante de la tecnología de cultivo celular porque proporciona una fuente confiable para comprender los procesos fisiológicos, morfológicos y moleculares normales en las células humanas.
Muchas entidades patológicas e histogénesis están conectadas a los fibroblastos ya que son las células principales del tejido conectivo de la mucosa oral. El cultivo de células de fibroblastos orales permite a los biólogos e investigadores de la boca explorar los procesos morfológicos y moleculares en los trastornos orales.