Kultur Sel Primer

Apa itu kultur sel primer?

Kultur sel primer adalah budidaya sel yang diperoleh langsung dari organisme multiseluler. Tahap pertama dalam kultur primer adalah mendapatkan jaringan dari manusia atau hewan; sering kali jaringan ini berupa massa jaringan yang harus dipecah menggunakan prosedur kimia, mekanik, atau enzimatik untuk memisahkan jaringan dan mendapatkan sel yang dapat hidup. Sel-sel hidup yang terpisah ini kemudian dirangsang untuk berkembang biak di wadah kultur menggunakan media yang canggih dan khusus.

Kultur sel primer dapat dibagi berdasarkan sifat sel seperti diferensiasi, adhesi pada permukaan, dan struktur morfologis. Sel-sel dibiakkan dan berkembang biak dalam media pertumbuhan yang sesuai hingga mencapai konfluensi - istilah yang digunakan untuk menggambarkan kondisi di mana sel-sel menempati seluruh area pertumbuhan wadah kultur - dalam semua metode kultur sel primer.

Kultur sel primer lebih erat hubungannya dengan kondisi fisiologis sel di dalam tubuh dan menghasilkan data yang lebih bermakna mengenai sistem hidup. Kultur primer adalah sel-sel yang baru diperoleh dari makhluk hidup dan dibiakkan in vitro (di luar tubuh hidup dan dalam lingkungan buatan). Sel primer diklasifikasikan berdasarkan genus tempat mereka diperoleh, serta spesies atau jenis jaringan.

Setiap jenis jaringan mamalia berasal dari lapisan germinal embrio, yang terdiri dari sel-sel ektoderm, endoderm, dan mesoderm yang berdiferensiasi menjadi berbagai jenis sel yang membentuk struktur tersier seperti kulit, otot, organ internal, tulang dan kartilago, sistem saraf, darah, dan pembuluh darah.

Sel epitel, fibroblas, keratinosit, melanosit, sel endotel, sel otot, sel hematopoietik dan sel punca mesenkimal adalah jenis sel yang paling umum diidentifikasi dalam kultur sel primer. Garis sel didefinisikan sebagai saat sel pertama kali dicangkokkan dari kultur primer. Kultur sel sekunder digambarkan sebagai penambahan lebih lanjut dari garis sel, di mana kultur sel secara berurutan dipindahkan melalui media pertumbuhan.

Apa Aplikasi kultur sel primer?

Kultur sel merupakan metode populer dalam penelitian biologi seluler dan molekuler, dan sering digunakan dalam pengaturan terapeutik. Kultur sel primer dapat menjadi sistem model yang efektif untuk meneliti fisiologi dan biokimia sel, toksisitas dan metabolisme obat, serta penggunaan obat lainnya. Kultur sel primer digunakan oleh para peneliti di seluruh dunia karena membantu menjaga keseragaman, efisiensi, dan reproduktibilitas hasil, serta menjadi model simulasi yang baik dari pengaturan fisiologis in vivo. Berikut adalah contoh aplikasi kultur sel primer:

Sistem Model 3D:

Kultur sel primer dapat digunakan untuk menjelajahi biologi dan biokimia sel, interaksi sel, interaksi patologis, efek obat dan toksikologi, penuaan, dan berbagai topik penelitian lainnya.

Penelitian Kanker:

Perbedaan antara sel normal dan sel kanker dapat diteliti menggunakan kultur sel primer sebagai model untuk penapisan penanda yang diekspresikan berlebihan atau diekspresikan rendah yang mengarah ke aktivasi ganas. Sel primer juga sering digunakan sebagai model kontrol dalam penelitian anti-kanker.

Virologi:

Kultur sel primer digunakan untuk mereplikasi virus dan juga dapat digunakan untuk mendeteksi dan mengisolasi virus untuk mempelajari siklus pertumbuhan dan perkembangannya. Sel primer juga digunakan dalam virologi untuk mempelajari mode dan mekanisme infeksi virus.

Uji Toksisitas:

Kultur sel primer digunakan untuk mempelajari efek obat baru, kosmetik, dan bahan kimia pada sel. Sel primer juga digunakan untuk menentukan dosis maksimal yang diizinkan dari obat-obatan.

Produksi Vaksin:

Sel primer yang dikulturkan digunakan dalam replikasi virus untuk membuat vaksin. Kultur sel primer digunakan untuk membuat vaksin polio, rabies, cacar air, dan hepatitis B.

Protein Rekayasa Genetika:

Kultur sel primer digunakan untuk membuat protein yang dimodifikasi secara genetik seperti antibodi monoklonal, insulin, hormon, dan lainnya. Banyak pengobatan yang sedang diubah dengan menggunakan teknologi rekombinan.

Penggantian Jaringan atau Organ:

Dalam penyembuhan luka dan aplikasi rekayasa jaringan lainnya, kultur sel primer dapat digunakan sebagai pengganti jaringan atau organ. Misalnya, kulit buatan dapat dibuat dari sel primer untuk menyembuhkan pasien dengan luka bakar dan ulkus. Budidaya organ buatan, seperti hati, ginjal, dan pankreas, sedang diteliti. Banyak peneliti tertarik pada budidaya sel punca karena sel-sel ini memiliki kemampuan untuk berkembang biak sendiri dan berdiferensiasi menjadi berbagai jalur sel. Banyak penggunaan terapeutik dari sel punca dewasa untuk regenerasi jaringan/organ dan teknologi penggantian sedang diuji.

Pemantauan dan Pengembangan Obat:

Kultur sel primer digunakan untuk menyelidiki sitotoksisitas dan dosis obat yang aman. Oleh karena itu, kultur sel primer memainkan peran penting dalam industri farmasi.

Sifat dasar sel primer

Sel primer mengalami sejumlah terbatas pembelahan sel sebelum mendekati senescence setelah beradaptasi dengan kondisi kultur in vitro. Batas Hayflick, kebutuhan makanan, kondisi kultur, dan kompetensi dalam mengelola dan mengkultur sel sub-melintasi jumlah kali kultur sel dasar dapat dilakukan. Di sisi lain, garis sel yang diimortalisasi melalui transformasi virus atau tumorigenik sering mengalami pembelahan sel tanpa henti dan memiliki masa hidup yang tak terbatas. Selain itu, berbeda dengan garis sel tumor, kultur sel primer bersifat sensitif, memerlukan kondisi pertumbuhan yang disesuaikan, seperti inklusi sitokinin dan faktor pertumbuhan spesifik jaringan untuk proliferasi dalam media pertumbuhan bebas serum atau dengan serum rendah.

Apa perbedaan antara kultur sel primer dan kultur sel sekunder?

Sebelum sel mencapai konfluensi, mereka perlu dikultur ulang karena kelelahan nutrisi, penumpukan metabolit toksik, dan ruang yang tersedia untuk pertumbuhan membatasi proliferasi. Inhibisi kontak adalah komponen tambahan dalam kasus sel yang melekat, di mana sel berhenti berkembang biak ketika mencapai konfluensi dan menempati permukaan wadah kultur. Konfluensi dapat lebih sulit dinilai dalam kultur sel yang tergantung, namun, sel cenderung membentuk gumpalan dalam medium.

Sel kultur primer memiliki masa hidup terbatas karena hanya dapat melakukan sejumlah pembelahan sel tertentu. Untuk merangsang pertumbuhan dan proliferasi yang berkelanjutan, mereka harus dikultur ulang ke media pertumbuhan yang segar atau substrat pertumbuhan baru sebelum mencapai konfluensi. Hal ini disebut sebagai kultur sel sekunder. Mekanisme yang serupa menyoroti kultur sel primer dan sekunder, namun perbedaan terletak pada masa hidup, pentingnya secara biologis, dan asal sel.

Seiring berjalannya proses kultur, sel dengan potensi pertumbuhan terbesar mendominasi, dan tingkat homogenitas genetik dan morfologis meningkat. Sel dapat mengembangkan garis sel sekunder yang diimortalisasi sebagai hasil perubahan genetik. Garis sel yang diimortalisasi, yang dibuat dengan penambahan virus atau bahan kimia, umumnya digunakan dalam penelitian karena kemampuan mereka untuk berbagi sel tak terbatas memungkinkan peneliti untuk melakukan studi pada sel yang genetiknya identik beberapa kali.

Demikian pula, sel-sel ganas dapat digunakan untuk menghasilkan garis sel kanker berkelanjutan dengan periode produksi yang pendek dan kemampuan untuk dilewatkan tanpa henti. Ketika sel tidak bertransformasi, mereka mengalami sejumlah pembelahan populasi terbatas dan oleh karena itu disebut sebagai garis sel terbatas.

Menggunakan kultur sel primer dan sekunder memiliki kelebihan dan kekurangan, dan keputusan ditentukan oleh tujuan eksperimen. Kultur sel primer sering lebih disukai daripada garis sel karena lebih mewakili jaringan asal. Sebaliknya, kultur primer adalah platform eksperimental terbaik untuk penelitian in vivo karena memiliki kecocokan genetik yang sama dengan jaringan induknya dan menampilkan karakteristik yang tidak dimiliki oleh sel yang dikultur. Kendala utama dari kultur sel primer adalah masa hidup terbatasnya. Selain itu, penting untuk mengevaluasi konsekuensi dan prosedur untuk mendapatkan biopsi atau model hewan yang bermakna.

Di sisi lain, kultur sel sekunder dapat bertahan selamanya karena mereka diperbarui dengan nutrisi dan substrat segar secara teratur. Namun, garis sel mengalami mutasi. Kultur sel sekunder dapat menjadi sama sekali tidak dapat dibedakan dari jaringan asalnya akibat pembelahan sel yang terus-menerus karena perubahan genetik dan morfologis.

Keterbatasan lain dalam kultur primer adalah generasi sel primer yang cukup untuk analisis. Secara umum, hal ini hanya dapat diatasi dengan memulai dengan jumlah jaringan yang lebih besar, yang mungkin sulit dilakukan. Namun, perkembangan dalam sensitivitas alat analisis menyediakan solusi. Teknologi sel tunggal, seperti sekuensing, blot barat, dan sitometri massa, misalnya, membutuhkan jumlah bahan awal yang relatif kecil, mengurangi kebutuhan untuk mengkultur jumlah sel primer yang besar.

Di sisi lain, kultur sel 3D memungkinkan sel tumbuh dan berinteraksi dengan kerangka ekstraseluler dalam tiga dimensi. Sebagai hasilnya, kultur 3D lebih mirip dengan kondisi fisiologis alami, memungkinkan sel berinteraksi satu sama lain dan dengan matriks ekstraseluler. Karena akurasinya dalam memprediksi reaksi in vivo, teknik ini telah membuktikan revolusioner dalam bidang seperti penemuan dan pengembangan obat. Hal ini telah menghasilkan teknologi terkini yang memberikan model-model yang sangat kontekstual untuk penapisan dan pengembangan obat, seperti organoid yang berasal dari pasien dan organ-on-a-chip.

Apa Manfaat Menggunakan Sel Primer?

Kultur sel primer sering digunakan sebagai alat in vitro untuk penelitian biologi preklinis dan investigatif, seperti penelitian interaksi seluler dan intraseluler, biologi perkembangan, dan penyelidikan mekanisme penyakit pada penyakit seperti kanker, penyakit Parkinson, dan diabetes.

Secara historis, para peneliti telah menggunakan garis sel yang diimortalisasi dalam penelitian fungsi jaringan; namun, penggunaan garis sel dengan mutasi dan kelainan kromosom yang parah memberikan penanda yang buruk terhadap fenotipe sel normal dan perkembangan penyakit pada tahap awal. Penggunaan sel primer, yang hanya dipelihara in vitro dalam waktu singkat, saat ini merupakan representasi terbaik dari komponen fungsional utama dari jaringan (in vivo) dari mana mereka berasal.

Bagaimana Kultur Sel Primer Dilakukan?

Isolasi sel primer:

Sentrifugasi diferensial atau pemisahan positif dengan menggunakan magnetik bead dapat digunakan untuk dengan mudah mengisolasi dan membersihkan sel darah tepi. Namun, pemisahan populasi sel yang murni dari jaringan primer sering kali menantang dan membutuhkan pemahaman tentang bagaimana lapisan sel harus dipisahkan menjadi suspensi yang hanya mengandung satu jenis sel utama.

Persyaratan pertumbuhan:

Kecuali yang berasal dari darah tepi, sel primer membutuhkan adhesi dan bergantung pada substrat, yang berarti mereka membutuhkan permukaan untuk berkembang dengan benar di dalam vitro. Sebagian besar sel primer dibiakkan dalam wadah plastik datar yang tidak dilapisi, namun dalam beberapa kasus, dapat digunakan mikropartikel yang dapat secara signifikan meningkatkan luas permukaan. Diperlukan media kultur sel yang lengkap, terdiri dari medium dasar yang ditambah dengan faktor pertumbuhan dan sitokinin yang sesuai.

Mungkin menguntungkan untuk menambahkan antibiotik dalam media pertumbuhan selama pembuatan kultur sel primer untuk membatasi kontaminasi yang dibawa dari jaringan inang. Ini dapat mencakup kombinasi gentamicin, penisilin, streptomisin, dan amfoterisin B. Namun, penggunaan antibiotik dalam jangka panjang tidak disarankan karena beberapa senyawa, seperti amfoterisin B, dapat merusak sel seiring berjalannya waktu.

Pemeliharaan:

Ketika sel-sel telah menempel pada permukaan wadah kultur, fase pemeliharaan dimulai. Lampiran biasanya dimulai sekitar 24 jam setelah inisiasi kultur. Saat memulai kultur sel primer yang dikriopreservasi, penting untuk menghilangkan medium yang terbuang setelah sel-sel melekat karena bahan krioprotektan bersifat toksik bagi sel primer dan dapat mengurangi viabilitas setelah pencairan.

Waktunya untuk melakukan subkultur ketika sel-sel mencapai persentase konfluensi seluler yang diperlukan dan sedang aktif berkembang biak. Karena sel-sel yang mencapai konfluensi seluler dapat mengalami diferensiasi dan menunjukkan penurunan proliferasi setelah dilakukan subkultur, idealnya kultur sel primer disubkultur sebelum mencapai konfluensi 100%.

Konfluensi seluler:

Fraksi dari wadah kultur yang ditempati oleh sel-sel yang terhubung disebut sebagai konfluensi seluler. Misalnya, konfluensi seluler 100% menunjukkan bahwa seluruh luas permukaan ditutupi oleh sel, sedangkan konfluensi 50% berarti hampir setengah luas permukaan ditutupi. Ini adalah metrik penting yang perlu dipantau dan dievaluasi dalam kultur sel primer karena berbagai jenis sel membutuhkan titik akhir konfluensi yang berbeda, setelah itu mereka harus disubkultur.

Subkultur:

Sel yang membutuhkan substrat untuk berkembang dalam lapisan tunggal membutuhkan subkultur berulang untuk mempertahankan pertumbuhan eksponensial. Subkultur monolayer membutuhkan penghancuran ikatan seluler antar sel dan intraseluler dengan substrat. Sebagian besar sel primer yang melekat membutuhkan pemutusan ikatan pelekatan protein menggunakan enzim proteolitik seperti tripsin/EDTA dalam dosis rendah. Setelah dipecah dan diencerkan menjadi larutan sel tunggal, sel-sel dihitung dan diencerkan ke konsentrasi yang tepat sebelum ditransfer ke wadah kultur segar tempat mereka akan melekat dan membelah.

Penghitungan sel:

Hemocytometer sering digunakan untuk mengevaluasi jumlah sel dan viabilitas menggunakan zat pewarna pengecualian seperti Trypan Blue atau Erythrosin B. Hemocytometer adalah gelas objek yang memiliki dua ruang hitung, satu di setiap sisi. Setiap ruang hitung memiliki permukaan cermin dengan kisi-kisi dari 9 persegi hitung berukuran 3 × 3 mm2. Ruang-ruang ini memiliki dinding samping yang tinggi yang memungkinkan penutup melingkar dipegang dengan tepat 0,1 mm2 di atas lantai ruang. Setiap dari sembilan persegi hitung memiliki kapasitas 0,0001 mL.

Kriopreservasi dan pemulihan:

Perhatian khusus harus diambil untuk mengurangi kerusakan dan kematian sel selama proses kriopreservasi dan pencairan. Kriopreservasi sel manusia bekerja dengan baik ketika digunakan krioprotektan, seperti DMSO atau gliserol. Sebagian besar kultur sel primer dapat dikriopreservasi dalam kombinasi media pertumbuhan lengkap 80%, FBS 10%, dan DMSO 10%. Untuk menghindari pembentukan kristal es dalam sel, proses pembekuan harus dilakukan secara bertahap, dengan kecepatan -1°C per menit. Kultur disimpan dalam fasa uap nitrogen cair, atau pada suhu di bawah -130°C.

Karakteristik untuk pengembangan yang efisien dari kultur primer

Kultur sel primer mengacu pada prosedur kultur yang digunakan setelah isolasi sel tetapi sebelum subkultur pertama. Massa jaringan besar biasanya digunakan untuk mempersiapkan kultur primer. Akibatnya, kultur ini dapat mengandung berbagai jenis sel yang berdiferensiasi, seperti fibroblas, limfosit, makrofag, dan sel epitel.

Berdasarkan pengalaman para pegawai yang bekerja di laboratorium kultur jaringan, berikut adalah kriteria/karakteristik yang disarankan untuk pengembangan kultur primer yang efisien:

• Jaringan embrionik lebih disukai daripada jaringan dewasa untuk kultur primer. Hal ini karena sel-sel embrio dapat dengan mudah dipecah dan menghasilkan sel yang lebih dapat hidup, selain juga berkembang biak dengan cepat in vitro.
• Jumlah sel yang digunakan dalam kultur primer harus ditingkatkan karena tingkat kelangsungan hidupnya lebih rendah (dibandingkan dengan subkultur).
• Untuk digunakan dalam kultur primer, jaringan harus diobati dengan kerusakan sel minimal. Sel-sel mati juga harus dieliminasi.
• Memilih medium yang memadai (idealnya yang kaya nutrisi) disarankan. Serum fetus sapi lebih disukai daripada serum anak sapi atau kuda untuk penambahan serum.
• Sentrifugasi diperlukan untuk menghilangkan enzim yang digunakan dalam pemecahan sel.

Kontaminasi dalam kultur sel

Kontaminasi dalam kultur sel merupakan masalah yang signifikan, namun terdapat beberapa pendekatan yang dapat digunakan untuk menghindari atau memberantas kontaminasi. Kontaminasi dapat terjadi akibat operator dan lingkungan laboratorium, serta sel lain yang digunakan di laboratorium dan bahan kimia. Beberapa patogen dapat membahayakan personel laboratorium; prosedur pengendalian dan aseptik merupakan garis pertahanan utama terhadap ancaman tersebut. Pengendalian infeksi yang dicurigai mungkin melibatkan penghapusan hanya satu kultur yang berpotensi terkontaminasi.

Jika ditemukan masalah yang lebih luas, semua kultur yang terkontaminasi dan media yang terbuka selama waktu tersebut harus dibuang, peralatan harus diperiksa dan dibersihkan, operasi kultur sel harus ditinjau, dan isolasi dari laboratorium lain harus dilakukan hingga masalah teratasi. Pelatihan staf, struktur laboratorium, karantina yang tepat untuk kultur atau garis sel baru, pembersihan dan pemeliharaan, serta pengendalian kualitas adalah aspek penting dalam mencegah kontaminasi di fasilitas kultur sel.

Kesimpulan

Kultur sel primer dibuat dengan menginokulasi sel langsung dari jaringan hewan atau manusia ke dalam media pertumbuhan. Jaringan tersebut sering kali dipecah menjadi bagian-bagian kecil sebelum diperlakukan dengan tripsin, enzim proteolitik yang memisahkan jaringan menjadi sel-sel individu.

Kultur sel primer mempertahankan sebagian besar fitur dari sel-sel yang berasal darinya, dan sering bergantung pada substrat. Sel-sel ini menunjukkan "hambatan kontak," yang menyebabkan sel-sel berbaris dalam untaian paralel yang rapat. Sel-sel ini dapat berkembang biak dalam wadah apapun hingga mencapai kepadatan maksimum, di mana mereka berhenti tumbuh. Dalam hal jumlah kromosom, sel-sel ini sering mempertahankan kariotipe diploid mereka.

Penggunaan sel primer melibatkan berbagai kesulitan. Salah satu tantangan terbesar bagi peneliti kultur sel primer adalah keterbatasan aksesibilitas sel akibat kendala pasokan jaringan donor, kesulitan dalam isolasi/pembersihan sel, jaminan kualitas dan konsistensi, serta ancaman kontaminasi. Komparabilitas data juga menjadi perhatian penting dalam penggunaan sel primer, karena variasi dalam bahan kimia yang digunakan dan proses yang digunakan oleh ilmuwan dan laboratorium yang berbeda untuk mengidentifikasi dan mengkultur sel primer.

Kultur primer merupakan kultur yang baru diisolasi dari sistem mamalia hingga disubkultur. Pada tahap ini, kultur tersebut seringkali heterogen, tetapi masih sangat menyerupai jenis sel induk dan menunjukkan fitur spesifik jaringan.

Setelah subkultur atau pasase awal, kultur utama akan berubah menjadi garis sel yang dapat diperbanyak atau disubkultur beberapa kali. Garis sel tersebut akan entah mati atau berubah menjadi garis sel yang terus-menerus setelah beberapa subkultur dengan media segar. Terdapat banyak perbedaan antara garis sel ini dan kultur asli, termasuk modifikasi dalam:

• Cytomorphology
• Laju pertumbuhan yang meningkat
• Peningkatan variasi kromosom
• Tumorigenicity

Transformasi in vitro secara utama berkaitan dengan perolehan umur yang tak terbatas. Sel hewan dapat dibiakkan dengan dua cara: dalam suspensi atau melekat pada permukaan padat. Mereka tidak memiliki hambatan kontak, dan beberapa dapat tumbuh dalam kultur suspensi yang tidak memerlukan substrat. Kariotipe dari garis sel bervariasi secara signifikan. Garis sel terus-menerus seringkali bersifat aneuploid, dengan jumlah kromosom antara diploid dan tetraploid.

Teknik kultur sel telah menjadi pendekatan standar dan populer karena berbagai penggunaannya dalam biologi sel, bioteknologi, dan penelitian medis. Isolasi sel primer dari sel kanker adalah komponen penting dalam teknologi kultur sel karena memberikan sumber yang dapat diandalkan untuk memahami proses fisiologis, morfologis, dan molekuler normal pada sel manusia.

Banyak entitas penyakit dan histogenesis terkait dengan fibroblas karena mereka adalah sel utama jaringan ikat mukosa oral. Kultur sel fibroblas oral memungkinkan ahli biologi mulut dan peneliti untuk mengeksplorasi proses morfologis dan molekuler dalam gangguan oral.